顯微鏡固定的具體方法可參考常電鏡樣品制備方法,徠卡顯微鏡免疫電鏡和電鏡細胞化學各章。顯微鏡所謂包裹(Encapsulation),顯微鏡就是利用某些大分子溶液浸透樣品的過程.這些大分子不會穿過細胞膜而進入細胞,只能占據細胞間的空隙,顯微鏡包裹的目的也是為了防止超薄切片在制備過程中被破壞。這一步對于顯微鏡分散的細胞樣品尤其必要。
如果徠卡顯微鏡樣品是游離細胞,可按下述步驟包裹:
1.將BSA加入一離心管內,顯微鏡濃度與上同;
2.把經過固定的細胞轉入離心管;
3.在冷凍離心機上離心10分鐘,800g, 40C;
4.去掉上清,數碼顯微鏡在管底沉淀上加一滴用0. lmol/L磷酸緩沖液配制的10%的戊二醛,使殘余的BSA交連;
5.用針把聚合后的團塊撥起,切成小塊。
為防止顯微鏡冷凍時生成大的冰晶而使結構破壞,組織需經冷凍保護劑處理,常用的冷凍保護劑有甘油(30%), DMSO (20%)和蔗糖(2.3mol/L),均用緩沖液配制,顯微鏡組織在冷凍保護劑中浸泡的時間為0.5-1小時(室溫)或過液((400)
為防止大的冰晶產生,數碼顯微鏡除使用冷凍保護劑外,應采取速凍的辦法,其基本要求與具體作法和冷凍斷裂與蝕刻時相同,即將經數碼顯微鏡冷凍保護的組織塊投入用液氮冷卻的氛里昂12內.
如果你的支架比較穩定,不會與各步驟中的試劑反應,然后你對于細胞的脫水變形也能接受,那就用常規的方法。
如果你的支架不穩定,細胞干燥形變后,脫水過程會溶解或者反應。而且細胞變形也不太好看,建議你可以用冷凍掃描電鏡。冷凍掃描電鏡是解決這樣的“困難樣品”的*方法。樣品直接冷凍到液氮泥里面,不經過其他脫水過程。*保持樣品原始狀態!